وفي سنة 303 أثار القيصر الروماني ديوقلطيانس، الاضطهاد على المسيحية، فسام المؤمنين صنوف العذاب، وأمر بإغلاق كنائسهم وإبادة كتبهم المقدسة، فسجن عدداً كبيراً منهم، ونفى آخرين، وكان نصيب رعاة الكنيسة من هذا الاضطهاد وافراً جداً، ومن بين هؤلاء الرعاة الصالحين كان مار نيقولاوس الذي زجّه جنود قيصر في غياهب السجون وأذاقوه مر الآلام.. وهو يتحمل كل ذلك بصبر جميل حباً بالمسيح الفادي، ومكث مار نيقولاوس مسجوناً حتى انتصر قسطنطين الملك على أعدائه وفتح أبواب السجون، فخرج المعترفون ظافرين، وعاد مار نيقولاوس إلى أبرشيته ليرعى الشعب الذي ائتمنه على رعايته.